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第158期 --使用东曹TOYOPEARL Sulfate-650F填料纯化九因子(凝血因子Ⅸ)

2023年02月06日来源:管理员
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 凝血因子是血浆与组织中直接参与凝血的物质的统称。其中已按国际命名法,用罗马数字按发现的次序编号的凝固因子有12种(原13种,VI其实是活化后的第五因子而被取消):凝血因子IIIIIIIVVVIIVIIIIXXXIXIIXIII。此外,还有前激肽释放酶、激肽释放酶,以及来自血小板的磷脂等。因子XIII以后被发现的凝血因子,经过多年验证,认为对于凝血功能,无决定性的影响,不再列入凝血因子的编号。因子VI事实上是活化的第五因子,已经取消因子VI的命名。除了Ca2+和磷脂外,其余已知因子都是蛋白质,多具有酶的特性,在血液中处于无活性状态,以保持血液的液体性。只有被激活后才有凝血作用。通常于因子名称后加“a”,以示其为活化状态,如II→IIa。多数凝血因子在肝脏合成且需维生素K参与。九因子(凝血因子IX的学名为凝血酶原复合物全名冻干人凝血酶原复合物,俗称九因子,为人体血浆制品,主要用于治疗乙型血友病。

离子交换色谱(IEC)因吸附量较大,被广泛应用于血浆蛋白的粗纯工艺。但是离子交换色谱容易受到样品中盐浓度的影响,如果样品溶液中含盐,则除了过滤以外,还需要进行脱盐、透析等前处理。但是,近几年市面上出现了一种不易受到盐浓度影响的耐盐型(salt-tolerant)离子交换填料,可以作为一种混合模式填料用于这类样品的纯化。

最近发表在期刊《Biotechnology Journal》上的一篇文献中,研究人员使用了东曹的耐盐型阳离子交换填料TOYOPEARL Sulfate-650F,从凝血酶原复合物浓缩液(PCC)中有效纯化凝血因子IXFactor IX,九因子)。


111.png

M. Begić et al., Salt-tolerant cation-exchanger containing sulfate groups as a viable alternative for mixed-mode type and heparin-base affinity resin, Biotechnol. J., 2021; 2100100, CC BY NC ND, https://doi.org/10.1002/biot.202100100

 

一、TOYOPEARL Sulfate-650F的简介

1. 带有硫酸根官能团的阳离子交换填料

 官能团为硫酸根(SO4-) ,S-SP-CM-等类型相似,同为阳离子交换填料。

 对抗体等蛋白有很高的吸附载量。

2. 可有效去除抗体中的多聚体

 相较于其他阳离子交换填料,对多聚体有着更高的分离效果。

 pH低于5.0、并含有0.15 mol/LNaCl缓冲液中仍然可以结合抗体,具有耐盐性

 可作为Protein A层析的后续纯化步骤。

3. 有类似于肝素亲和填料的分离纯化效果

 可以应用于AT-III和其他相关蛋白的分离纯化。

 有望应用于病毒和疫苗的分离纯化。

4. 适用的缓冲液pH范围

 一般可以用于pH 4-12的缓冲液中。

 可以用pH 3-13的清洗液进行短时间的CIP处理。


二、TOYOPEARL Sulfate-650F的基本参数

 

性能指标

规格参数

蛋白吸附载量

静态

动态

 

114g/L(human IgG)

95g/L

离子交换容量

0.53eq/L

粒径

80%(30-60μm)

菌落总数

100 CFU/ml

内毒素等级

10.0 EU/ml

不溶物

0.2%(干胶)

异物(colored

6 颗粒

出货溶剂:含0.2mol/L醋酸钠的20%乙醇溶液

 

三、TOYOPEARL Sulfate-650F适用样品

 单克隆抗体

 血浆蛋白、凝血因子

 病毒、VLP、疫苗

 重组蛋白

 碱性蛋白

四、TOYOPEARL Sulfate-650F的主要特点

 高载量

 多聚体分离

 耐盐的阳离子交换填料

 与肝素亲和作用相似(硫酸根官能团)

五、TOYOPEARL Sulfate-650F的应用条件

1. 单克隆抗体多聚体的分离纯化

 IgG可达到100 g/L的高载量。

 可以作为Protein A亲和层析的后续纯化步骤。

2. pH 5 以下具有耐盐性

 pH 4.70.15 mol/L NaCl的缓冲液中可以对样品进行吸附。

 Protein A 亲和层析或前处理后可以直接进行上样。

3. 硫酸根官能团的特异性相互作用

 与肝素亲和层析相似,可以与凝血因子、疫苗或病毒结合。

 可以用0-1 mol/LNaCl进行盐梯度洗脱。

 与竞争对手的Sulfate填料具有类似的吸附性能,但是Sulfate-650F具有更高的吸附载量(某些填料由于孔径小,所以蛋白只能结合在填料的表面)。

4. 常用的分离条件

 上样缓冲液的pH要控制在5.5以下。

 优化缓冲液的pH和盐浓度能够获得更好的分离效果。

 当缓冲液的pH4.2时,即使在0.3mol/LNaCl的缓冲液中也能够获得很高的吸附载量。

六、凝血因子IX的纯化实例

下图是使用耐盐型阳离子交换填料TOYOPEARL Sulfate-650F分离PCC中的维生素K依赖性凝血因子的结果。

222.png

首先,使用含有0.4 mol/L NaCl的高盐浓度洗脱液,让吸附较弱的凝血因子II、因子VII、因子X不被填料吸附直接流穿。然后,通过降低盐浓度和提升pH的阶梯梯度洗脱,把吸附在柱子上的因子IX洗脱下来。使用Sulfate-650F无需对样品进行脱盐处理,即可获得与使用肝素亲和层析相同纯度的因子IX

七、TOYOPEARL Sulfate-650F在类似于肝素亲和填料方面的应用展望

1. 类似于肝素亲和填料的分离纯化作用*

 凝血因子:Factor VIIFactor IXFactor X、凝血酶、AT-III

 组织纤溶酶原激活物(TPA

 脂肪酶、核酸酶有关如限制性内切酶、胶原酶、脂蛋白

2. 利用硫酸根官能团的相互作用*

 病毒、疫苗

、订货信息

 

货号

描述

023468

TOYOPEARL Sulfate-650F, 250ml

023469

TOYOPEARL Sulfate-650F, 1L

023470

TOYOPEARL Sulfate-650F, 5L

023471

TOYOPEARL Sulfate-650F, 50L

45205

SkillPak TOYOPEARL Sulfate-650F 1 ml×5

45241

SkillPak TOYOPEARL Sulfate-650F 5ml×1


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